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抗体常见问题解答

抗体常见问题解答

 

常见问题:

1.   如何选择合适的一抗?

2.   如何选择合适的二抗?

3.   如何选择合适的同型对照?

4.   如何选择阳性对照?

5.   如何确定一抗的稀释比例?

6.   如何选择合适的抗原修复方式?

7.   为何WB检测条带大小与预期有差别?

8.   抗体能够用于其他种属/实验方法?

9.   如何确定抗体是否能用于未经验证的种属?

10.  抗体能否与该蛋白的其它亚型或同一家族其他蛋白交叉反应?

11.  如何保存抗体?

12.  如何分装抗体?

13.  能否提供抗体的免疫原序列?

1、如何选择合适的一抗?

请先确定您要检测的种属和使用的实验方法,然后查找相关产品,根据说明书上描述的适用种属和实验方法来确定合适的抗体。如果说明书中有明确您要检测的种属和实验方法均经过检测,则您可以放心地购买该产品。如果说明书中没有注明您用的种属和实验方法经过验证,那么请参考第8910条。

Abcam网站所有说明书都是根据验证情况(Abcam实验室以及客户)实时更新的,所以可以放心参考!

2、如何选择合适的二抗?

二抗的选择原则:

  • 针对一抗来源的二抗(比如一抗是小鼠来源的,二抗就要是抗小鼠的)
  • 针对一抗Ig亚型的(比如一抗是IgM,二抗就要是抗IgM的抗体)
  • 为了增加特异性、降低背景:可以选择Fab段的抗体(去除Fc段的)、经过标本来源种属血清吸附的的二抗
  • 查看二抗的说明书,选择经过验证可以用于相应实验方法的二抗

Abcam提供各种种属、各种类型和标记的二抗,完全满足您实验的需要:

  • 可以通过一抗说明书页面的“Related Products”来选择合适的二抗
  • 通过产品分类目录选择合适的二抗

3、 如何选择同型对照?

同型对照的主要目的是确定一抗的结合是特异性的,而不是非特异性的Fc受体或与其他蛋白的相互作用。同型对照要与一抗的来源、Ig分型和标记完全一致。例如:一抗是FITC标记,其抗体分型是小鼠的IgG1,则同型对照要选择是FITC标记的小鼠的IgG1

Abcam提供各种种属和Ig分型的同型对照产品,可以在Abcam51AB的网站,产品分类“Isotype”/“同型对照中查找和选择合适的产品

多抗的同型对照:

绝大部分的同型对照产品都是单克隆抗体,因此不适用于作为多克隆抗体的对照(因为多抗含有多种IgG的亚型)。Abcam同样提供了几种多抗的同型对照产品,满足实验者的需要。

4、如何选择阳性对照?

阳性对照的使用是一个实验中确定抗体及检测系统是否正常工作的依据,也是确定待测标本中是否存在待测蛋白的一个依据!尤其是检测的标本是不确定是否有待测蛋白表达时。因此当实验没有阳性结果出现时,最好的选择是实验合适的阳性对照。

大部分Abcam的说明书上都有推荐的阳性对照。但是如果说明书上没有推荐时,请参考以下条款:

  • 看看说明书中是否有Abreviews。任何被其他客户成功检测的组织、细胞或者裂解物均可以作为合适的阳性对照!
  • 根据说明书上的Swiss-Prot Omnigene 数据库来查找。这些数据库经常会列出该蛋白表达的组织,这也可以作为合适的阳性对照!
  • 查查该蛋白的GeneCards 吧,这里通常会有蛋白在不同组织的表达水平。
  • 如果上述方法还是不能找到合适的阳性对照,推荐您去PubMed 查查发表文章,看看有无文章报道该蛋白表达的细胞和组织

5、如何确定一抗的稀释比例?

如果说明书中有推荐的稀释比例,请按照该稀释比例进行实验。但是由于标本类型、实验条件、操作环境等各种因素的影响,推荐浓度仅作为参考。实验者需要在推荐浓度周围进行多个浓度梯度的实验,从中发现最佳的稀释比例。

如果说明书没有推荐稀释比例,仅注明“Use at an assay dependent dilution”,就需要做大量的预实验来摸索最佳的比例了。下表列出的纯化抗体抗体用于不同实验方法时常用的工作浓度,可以作为预实验的参考。未纯化的抗体一般在说明书中不会标明抗体的浓度,因为大部分全抗血清、培养上清或腹水形式的产品浓度都是没有经过测定的。如果未纯化抗体产品的说明书中没有标明其中特异性抗体的浓度,实验者可以参考下表中估计浓度确定各种实验稀释比例。

请记住,下表中的各种稀释比例和工作浓度仅仅是作为一个起始点,需要根据试验结果来进行适当的调整。最好以此起点作一系列的浓度,从中确定最佳的工作浓度和稀释比例!

 

组织培养上清

腹水

全抗血清

纯化抗体

WB / dot blot

1/100

1/1000

1/500

1 ug/ml

IHC / ICC

neat - 1/10

1/100

1/50 - 1/100

5 ug/ml

EIA / ELISA

1/1000

1/10000

1/5000

0.1 ug/ml

FC

1/100

1/1000

1/500

1 ug/ml

IP

 

1/100

1/50-1/100

1 - 10 ug/ml

Concentration estimate

1 - 3 mg/ml

5 - 10 mg/ml

1 - 10 mg/ml

 

6、如何确定适用于某种特定抗体的抗原修复方法?

有些抗体对抗原修复方式有特别要求的,一般在其说明书中都会有明确的标注和推荐。但是很多抗体并没有一个特别的推荐,就需要实验者自己来进行优化和摸索了。可以参考51AB网站实验方法中免疫组化实验方法以及abcam网站的的IHC protocols page 查看更多的抗原修复方法

7、为何实际检测到的WB条带与预期的有所区别?

WB是根据蛋白质的大小来分离蛋白的,通常小分子量蛋白在凝胶中的迁移速度要快。但是迁移率也是受到其他因素影响的,这就造成了实际检测到的条带与预期条带的不一致。主要有以下几种常见因素:

  • 翻译后修饰-比如磷酸化、糖基化等,这些修饰会增加蛋白质的分子量
  • 翻译后剪切- 比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的,在执行功能时需要进行剪切成活化的形式,如pro-caspases
  • 不同剪切体有些来源于同一基因的蛋白有不同的剪切方式,每个剪切方式得到的蛋白大小都是不同的
  • 相对电荷(Relative charge氨基酸的组成(charged vs non-charged)
  • 多聚体-如二聚体或三聚体。这些多聚体的形式通常会抵制WB时所做的还原条件,因此造成检测的条带偏大。

8、抗体是否能用于其他种属/实验方法?

关于某个抗体所有经过检测的种属和用途都标明在说明书上,并且会根据最新验证情况及时得到更新。

如果您希望购买某个产品用于未经验证的种属或者用途,我们鼓励您使用并将实验结果通过在线Abreview来发表(不论是阳性还是阴性的结果),这些结果会对其他的客户起到参考的作用。对于每篇评论,我们会提供相应的积分(Abpiont),可以用于兑换礼品或折扣券来进行下次购买产品

9、如何确定某个抗体是否能用于未经验证的种属?

Abcam不能保证某个抗体能够成功的用于未经我们验证的种属,即使其序列同源性很高。因为一个抗体能否用于检测其他种属的影响因素是非常多的。

如果没有其他的选择,您需要考虑购买抗体用于未经检测的种属时,推荐您先确定下该抗体所用免疫原与您要检测蛋白的序列同源性。您可以通过网上说明书中Swiss-Prot来检测,也可以通过其他网站来查找。如:EMBL-EBI,将说明书中的抗体免疫原序列和您要检测蛋白的序列输入后比较相同性。如果相同性超过85%,则该抗体能成功检测您要测蛋白的可能性会比较高;但是,即使序列相同性超过85%,我们也不能保证该抗体一定能成功用于您的实验。

10、抗体能否与该蛋白的其它亚型或同一家族其他蛋白交叉反应?

对于一些抗体,说明书中明确指出了与其他蛋白的交叉反应(在‘specificity’ 项里)。如果说明书中没有相关信息的话,我们推荐您比较该抗体的免疫原序列和其他您希望了解的蛋白序列。您可以通过以下网站来进行序列的比较:EMBL-EBI 将说明书中的抗体免疫原序列和您要比较蛋白的序列输入后比较相同性。如果相同性超过85%,则该抗体与比较蛋白交叉反应的可能性会比较高;如果要确定没有交叉反应,则比较出来的同源性要非常低才行。

11、如何保存抗体?

我们坚持推荐您按照说明书上的推荐的储存方式来保存抗体。如果您没有按照要求来保存抗体,那么我们很难保证抗体的效果

请仔细阅读我们的抗体保存指南

12、如何分装抗体?

请根据一次实验的用量来分装抗体,但是每份不应该少于10ul。分装的体积越小,抗体浓度受蒸发和管壁吸附的影响越大。

请仔细阅读我们的抗体保存指南

13、是否能够提供抗体的免疫原序列?

有些抗体其免疫原序列并不会标明在说明书上。因为筛选合适的免疫原以产生最有效的抗体,其工作量是非常之大的,因此有时这些序列只有在客户特别索取时,才提供。对于某些非Abcam自产的抗体,免疫原序列是商业机密,很抱歉我们不能提供给您(即使单独索取)

对于特异性表位(免疫原中的抗体结合区)基本上不会提供的,因为这是最核心的商业机密。


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