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测序常见问题与解答

Q-1:
DNA测序样品用什么溶液溶解比较好?
A-1:
溶解DNA 测序样品时,用灭菌蒸馏水溶解最好。DNA的测序反应也是Taq 酶的聚合反应,需要一个最佳的酶反应条件。如果DNA用缓冲液溶解后,在进行测序反应时,DNA溶液中的缓冲液组份会影响测序反应的体系条件,造成Taq 酶的聚合性能下降。
有很多客户在溶解DNA测序样品时使用TE Buffer。的确,TE Buffer能增加DNA样品保存期间的稳定性,并且TE Buffer对DNA测序反应的影响也较小,但根据我们的经验,我们还是推荐使用灭菌蒸馏水来溶解DNA测序样品。
 
Q-2:
提供DNA测序样品时,提供何种形态的比较好?
A-2:
建议老师提供质粒和PCR产物, 一定要注意样品纯度和数量,如果老师提供的质粒浓度太低不能测序,我们就需要对质粒进行转化,此时需收取转化费。有些质粒提取法提取的DNA质量很好,象TaKaRa、Qiagen、Promega的质粒制备试剂盒等。
提供的测序样品为PCR产物时,特别需要注意DNA的纯度和数量。PCR产物必须进行切胶回收,否则无法得到良好的测序效果。
有关DNA测序样品的详细情况请严格参照“测序样品的提供”部分的说明。
 
Q-3:
测序结果有很多套峰(出现很多N),还照常收费,为什么?
A-3:
DNA模板上出现二处以上的引物结合位点,或者DNA模板上有严重的重复序列,以及测序引物不纯时, 测序结果便会出现套峰现象。出现这种现象的原因由DNA模板本身或者引物(限非TaKaRa合成的引物)本身所造成,对这些结果,公司会根据具体情况进行收费(详细见测序结果说明)。
 
Q-4:
为什么用PCR产物测序时,经常会出现套峰现象?
A-4:
PCR产物测序出现套峰现象,一般有以下几种原因:
PCR用模板不纯或PCR用引物特异性不好,扩增出的产物除了目的片段外,还有与目的片段长度相近的片段,即使用凝胶电泳也无法分离开,这样的PCR产物测序结果是套峰。
结构上的原因,造成了PCR产物测序出现套峰的现象。Poly A,Poly T以及原因不明的复杂结构的存在,都会出现测序结果套峰的情况,具体请看问答A-5。
 
Q-5:
测序结果不到500 Bases,还照常收费了,为什么?
A-5:
如在DNA样品中的DNA序列分布匀称,没有复杂结构时,正常的测序反应能保证达到500 Bases以上。
但有一些DNA样品立体结构复杂,造成聚合酶延伸反应终止,测序信号突然减弱或消失,或者测序结果出现套峰现象。出现这些现象的原因由DNA模板本身所造成。 对这些结果,公司会根据具体测序情况,进行收费(详细见测序结果说明)。出现这些情况的原因分析如下:
G/C rich、G/C Cluster。这种情况一般表现为测序信号突 然减弱或消失
A、T的连续结构。这种情况一般表现为A、T连续结构后 面的测序结果出现套峰。根据文献记载,原因在于聚合酶进行聚合反应时,由于A或T的连续,聚合酶难以识别完整的每个A或T,在某个A或T的后面便开始进行A或T连续结构以后序列的聚合反应(打滑现象),造成测序结果紊乱,出现套峰。
一般在多少个A或T的后面能出现这种情况呢? 现在还没有这方面的报道。根据我们的经验,这一情况的出现和A或T的连续结构后面的序列的排列情况有着直接的关系。有时10多个A或T的连续结构后面便出现套峰,但有时60~70个A或T的连续结构后面的序列也一样可以完整地读出来。具体情况还有待考证。
一般来说,PCR片段直接测序时,A或T的连续结构后面的序列测序结果都会出现套峰。原因在于测序时经历了PCR反应及测序反应(测序反应本身也是PCR反应)二次聚合酶的打滑现象。
原因不明的复杂结构,测序结果出现突然信号减弱或消 失。从序列上看,DNA碱基排列并无特别异常。估计是DNA整体出现复杂结构,从某一位置开始聚合酶的聚合反应便无法进行。
 
Q-6:
为什么在测序结果上找不到测序引物的序列?
A-6:
目前使用的测序方法是在ddNTP上做荧光标记,测序仪通过检测ddNTP上的荧光来读取序列,因为引物本身是不做荧光标记的,所测序列是从引物3′末端后第一个碱基开始的,所以在测序结果上找不到测序引物的序列。如果是PCR产物,要想得到PCR引物的序列,可以将PCR产物进行双链测通或者将PCR产物克隆到载体上,用载体上的引物(注意此引物也不能离插入片段太近)测序。
 
Q-7:
在测序结果上,找不到测序用引物后面的序列,为什么?
A-7:
由于测序仪自身缺陷,紧接引物之后的测序结果信号较弱,一般在测序用引物后面几个至数十个(严重时40~50个)碱基会读不出来(或者读错),请引起注意。
 
Q-8:
怎样使用TaKaRa提供的测序报告?
A-8:
在我们提供的测序报告中,有一份打印的(并用E-mail提供)DNA碱基排列顺序的测序结果。这个结果是我们根据测序仪的自动分析结果,并经严格确认后打印(并用E-mail提供)的测序结果。但测序仪有时会发生误读或漏读现象,而我们的工作人员在检查时也没有发现,这时的打印结果(并用E-mail提供)会出现错误。只有原始的测序彩色波形图才是最正确的,请客户拿到结果后,进行详细确认。如有不明白的地方,请立即和我们联系,我们会随时确认并进行解决。
 
Q-9:
PCR片段直接测序和PCR片段经克隆后测序的结果有何区别?
A-9:
众所周知,PCR扩增过程中会出现很多错配现象,但不可能所有的错配都发生在同一位置。PCR片段直接测序时,其结果是PCR片段众多分子的混合物的结果。如果在某一个点上出现了几十次错配现象,但大多数分子(或许是几十万个分子)在这个点上应该还是正确的,在测序时,错配现象也就反映不出来了。因此,PCR片段直接测序的结果反映的是PCR用模板最原始的结果。而PCR片段经克隆后测序是测定了某一个分子的DNA序列。在几十个循环的PCR扩增过程中,很难保证某一个分子的任何点都不发生错配。因此,PCR片段经克隆后的测序结果,往往存在着一些错配的序列,和PCR片段直接测序的结果相比有些碱基会有所不同。这种错配现象的多少取决于PCR扩增时使用的DNA聚合酶的保真性能。要减少PCR扩增过程中的错配现象,在PCR反应时,请选用保真性能高的DNA聚合酶 (详细请阅读「一般PCR相关制品」部分)。
 
Q-10:
测序结果和文献资料不一样,为什么?
A-10:
原因有很多,如同一种动物,在不同的种族之间,或者不同的个体之间,基因序列也不一定完全一样。如果是PCR产物克隆测序, 那还有PCR过程中的错配因素等等。我们提供的测序结果是客户样品序列的忠实结果,不能保证和文献序列完全一致,请理解。
 
Q-11:
DNA片段很长,一个反应读不到头,怎么办?
A-11:
如果DNA片段在载体上,可以用载体上两端的引物同时测序,让其中间交叉互补,便可完全测通。如果这样还读不通,可根据已经测出的序列设计测序引物作进一步测序(此称为Primer Walking法),便可完全测通。
 
Q-12:
测序完成后,测序样品和引物将如何处理(或保存)?
A-12:
客户需要将测序样品或引物(客户自带的)返还时,我们在发送测序报告的同时,按客户要求寄回样品或引物(客户自带的)。
对于没返回的测序样品和引物,公司负责保存三个月(从样品收到之日算起),超过三个月还需测序的样品,请客户另行提供。
 
Q-13:
对于测序结果有疑问怎么办?
A-13:
请客户仔细阅读“测序结果说明”和“问答”的内容,如果还有疑问,请您在收到测序结果一个月之内与我们联系,我们会及时、认真给您检查测序结果,分析原因。
 
Q-14:
怎样选择(设计)测序用引物?
A-14:
测序用引物要求非常严格,不同于PCR用引物。PCR用引物一般只要能和模板结合,3′端的几个碱基能完全配对,即使引物长达80~100多个碱基,只要调整PCR反应条件,也能成功进行PCR反应。
而测序用引物便不一样了,必须严格符合以下要求。本公司的测序用引物全用引物设计软件Oligo设计。在本公司测序时,我们可免费帮助设计测序用引物。
长度在15~25个碱基左右,一般选择20个碱基(根据GC 含量作适当调整),3′端尽量选择G或C碱基 (但不绝对),以增加与模板的结合能力。
Tm温度应选择50℃~70℃左右。(根据所用设计引物的软件不同,温度选择范围不同)
GC含量应选择在50%左右,尽量避开A、T、G、C的连续 结构。
避开引物自身形成发夹结构或引物二聚体结构等复杂结 构。
保证引物和模板100%匹配,特别是3′端的几个碱基一定 要100%匹配。同时必须严格保证引物和模板之间只能有一个结合位点。
 
Q-15:
怎样填写 cosete  DNA测序服务登记卡?
A-15:
请填写用户的详细信息。
仔细阅读“测序样品的提供”部分,具体填写测序样品的 详细信息。填写示例参考如下。
为了保证您的样品及时准确的进行测序,请务必阅读“测序样品的提供”说明后,按照要求详细、准确填写下表。
 
 

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